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SÍNTESIS DE BIOMATERIALES, PRUEBAS DE BIOCOMPATIBILIDAD IN
VITRO, PRIMEROS PASOS EN INGENIERÍA TISULAR EN BOLIVIA
SYNTHESIS OF BIOMATERIALS, IN VITRO BIOCOMPATIBILITY TESTS, FIRST STEPS IN TISSULAR
ENGINEERING IN BOLIVIA
FLORES - Irma
1
, GUTIERREZ - Blanca
1
, ESCALERA - Mavis
1
, CALIZAYA - Edsson
1
, SALAZAR - Ivana
1
,
VILLARROEL - Erik
1
, SOLIS - Javier
1
, MIRANDA – Andres
2
, ANTEZANA – Alex
3
, ARZABE - José Omar
1
1 CITEMA, Dpto. de Química, FCyT, UMSS, Cochabamba, Bolivia
2 Carrera Biología, FCyT, UMSS, Cochabamba, Bolivia
3 Centro de Traumatología Deportiva, Cochabamba, Bolivia
o.arzabe@umss.edu.bo
Sucre, Bolivia
Resumen
El desarrollo de biomateriales bioactivos como andamios para la osteointegración o regeneración de tejidos ha
dado grandes pasos, el presente trabajo, muestra los procesos de síntesis de biomateriales como la
hidroxiapatita, biomateriales del sistema SiO2-CaO-P2O5-Al2O3 y biovidrios del sistema SiO2.Li2O, se ha
logrado caracterizar los biomateriales obtenidos, con resultados similares a los de otros investigadores por
técnicas con la Difracción de Rayos X y la Microscopía Electrónica de Barrido, se ha evaluado su comportamiento
en pruebas de biocompatibilidad y bioactividad en soluciones de Plasma Rico en Factores de Crecimiento y
Fluido corporal simulado, seguidamente y con el fin de evaluar la incorporación de sustancias antibacteriales
se ha dopado uno de ellos con plata, logrando determinar que el material tiene esta capacidad, estos resultados
son los primeros pasos para encarar posteriores trabajos en el campo de la Ingeniería Tisular en Bolivia, y de
esta forma encarar procesos de ostointegración y regeneración de tejidos en general.
Palabras clave: Ingeniería tisular, Síntesis, Biomateriales, biocompatibilidad in vitro
Abstract
The development of bioactive biomaterials as scaffolds for osseointegration or tissue regeneration has taken
great steps, the present work shows the synthesis processes of biomaterials such as hydroxyapatite,
biomaterials of the SiO2-CaO-P2O5-Al2O3 system and bio-libraries of the SiO2 system. Li2O, it has been possible
to characterize the biomaterials obtained, with results similar to those of other researchers by techniques with
X-ray Diffraction and Scanning Electron Microscopy, their behavior in biocompatibility and bioactivity tests in
Plasma Rico solutions has been evaluated in Growth factors and simulated body fluid, then and in order to
evaluate the incorporation of antibacterial substances, one of them has been doped with silver, managing to
determine that the material has this capacity, these results are the first steps to face further work in the field of
Tissue Engineering in Bolivia, and thus face Osteintegration processes and tissue regeneration in general.
Key words: Tissue engineering, Synthesis, Biomaterials, in vitro biocompatibility
Recibido en 13 de septiembre de 2018
Aceptado en 21 de octubre de 2018
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Introducción
Hoy en día hablamos de un nuevo concepto,
conocido como “Ingeniería Tisular”, entre los
objetivos de este novedoso campo están la
regeneración, reparación o reemplazo
bioartificial de tejidos y órganos propios del
cuerpo humano, que han sido dañados por
diversos factores, tales como trauma,
quemaduras, por enfermedades adquiridas
como el cáncer o ciertas anormalidades
congénitas, se basa en tres componentes
fundamentales: Células, Andamios y
Biomoléculas, inductores o factores de
crecimiento (1).
Entre los andamios utilizados se puede hablar
de los biomateriales, nos referimos a los
materiales que interactúan con sistemas
biológicos y que se aplican en diversas ramas
de la medicina. Estos pueden dividirse en
biocompatibles y bioactivos, los primeros no
sufren modificaciones durante su servicio, los
segundos tendrán una interacción dentro del
sistema (2).
El campo de aplicación de los biomateriales es
amplio y abarca elementos y dispositivos de
uso diario en centros de salud, como jeringas,
vendajes, catéteres, etc. hasta piezas
sofisticadas que se utilizan en la regeneración
de tejidos o remplazo de órganos, es el caso de
prótesis de distintos usos, implantes y otros
(3).
El desarrollo de nuevos andamios con
características de biomateriales con
propiedades físicas, químicas y mecánicas
debe seguirse explorando; actualmente, la
combinación de colágeno, hidroxiapatita,
péptidos osteogénicos y células madre, es el
biocomplejo idóneo (1).
En la búsqueda de distintos andamios con
características biomateriales la presente
investigación estudió los procesos de
biocompatibilidad in vitro de diferentes
materiales sintetizados en nuestros
laboratorios, es el caso de hidroxiapatita
sintética (4), biovidrios del sistema SiO2-CaO-
P2O5-Al2O3 (5) y biovidrios del sistema
SiO2.Li2O (6), logrando su caracterización
química, mineral y estructural, su actividad
bioactiva fue evaluada en pruebas sobre fluido
corporal simulado y en algunos casos en
plasma rico en plaquetas, se estudió también la
actividad antimicrobiana de algunos dopantes
utilizados en la preparación de los
biomateriales, logrando obtener materiales
que en un futuro puedan ser utilizados en
ensayos in vivo, siguiendo los protocolos
correspondientes a este tipo de
investigaciones, es decir presentación al
comité de ética y obtener el consentimiento
informado ya sea para trabajos en animales o
humanos.
Métodos
Síntesis de biomateriales
- Hidroxiapatita
La hidroxiapatita se sintetizó por via húmeda a
partir de la siguiente reacción:
10Ca(NO
3
)
2
+ 6(NH
4
)
3
PO
4
+ 2NH
3
·H
2
0 →
Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
+ 20NH
4
NO
3
(2)
La síntesis incluye los siguientes pasos:
- Preparación de las soluciones de Ca(NO
3
)
2
y (NH4)
3
PO
4
en concentraciones
adecuadas,
- Adición de amoniaco NH
4
·OH.
- Adición de solución de Ca(NO
3
)
2
gota a
gota sobre la solución de (NH4)
3
PO
4
bajo
agitación constante por 24 horas.
- Reposo, filtración y lavado del precipitado
formado
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- Secado y calcinación a 1100°C.
- Biomateriales del sistema SiO2-CaO-
P2O5-Al2O3
El procedimiento de síntesis por proceso de
sol.gel es el propuesto por Balamurugan A. y
col. (7):
- Utiliza como base Zeolita Clinoptilolita, en
una solución 0,1 M de Ácido nítrico y se deja
reaccionar bajo agitación durante 60 [min]
en un frasco de vidrio con tapa a
temperatura ambiente.
- Síntesis de Biovidrio base (BG), se agregan
los siguientes compuestos en secuencia, con
un intervalo de 45 [min] entre un reactante
y otro: Trietilfosfato (TEP) y Nitrato de
Calcio Tetrahidratado.
- Se agrega de carbonato de calcio y de
carbonato de sodio, después de agregar el
último reactivo se continúa agitando por 1
hora.
- Para el caso de Biovidrios dopados con
plata (BGAg), el recipiente de vidrio se
cubre con papel aluminio, dado que la plata
es fotosensible, se esperan 45 min luego de
agregar Nitrato de Calcio y se agrega
Nitrato de Plata y se continúa agitando por
1 hora.
- Biomateriales Li2O-SiO2
El proceso de sintesis se realizó por fusión a
partir de ceniza de cascara de arroz como
fuente de SiO2 y Li2CO3 obtenido a partir de
los recursos evaporiticos del Salar de Uyuni.
- Preparación de una mezcla de polvos con
una composición de 72 % de SiO
2
y 28 % de
Li
2
O.
- Fusión en Horno de microondas con iglu de
alta alúmina y crisol de carburo de silicio a
una temperatura aproximada de 1200 °C.
Caracterización de los biomateriales
- Análisis Químicos
El análisis químico se realizó por métodos
tradicionales de volumetría y colorimetría
para los elementos mayoritarios, y
Espectroscopía de Absorción atómica para los
elementos minoritarios.
- Difracción de Rayos X
El análisis mineralógico de fases sólidas
cristalinas se realizó en un equipo de
Difracción de Rayos X (DRX) marca
PanAnalitical Expert Plus con tubo generador
de Rayos X de Cu (cobre) y filtro de Ni,
radiación K alfa del Cu con longitud de onda de
1.54178 Å, bajo las condiciones de operación:
Radiación a 40 Kv. y 40mA., rango de registro
de 3º a 60º, velocidad de barrido del
goniómetro de 2/min, escala de detección
automática, del Instituto de Investigaciónes
Geológicas de la Facultad de Ciencias Puras y
Naturales de la Universidad Mayor de San
Andres.
- Microscopía Electrónica de Barrido
(MEB)
El equipo utilizado fue el Microscopio
Electrónico de Barrido (JSM - T100 SCANNING
MICROSCOPE) del Instituto de Investigaciones
Geológicas de la Universidad Mayor de San
Andres, nos permitió obtener micrografías de
los materiales obtenidos y las modificaciones
microestructurales luego de ser sumergidos en
Fluido Corporal Simulado y Plasma Rico en
Plaquetas.
Ensayos de Biocompatibilidad
- Preparación de Fluido Corporal
Simulado (SBF)
Se preparó 1000 ml de SBF, con 700 ml de agua
destilada en un recipiente plástico de 1000 ml.
en baño de agua termoregulado a 36± 1,5℃
bajo agitación, adicionar los reactivos uno por
uno, en el orden que aparece en la Tabla 1
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siguiendo la metodología de Tadashi Kakubo
(8).
Tabla 1. Reactivos para la preparación de SBF
N°
Reactivo
Cantidad
Pureza
(%)
NaCl
8,035 g
99,5
NaHCO3
0,355 g
99,5
KCl
0,225 g
99,5
K2HPO4*3H2O
0,231 g
99,0
MgCl2*6H2O
0,311 g
98,0
HCl
39 ml
-
CaCl2
0,292 g
99,5
Na2SO4
0,072 g
99,0
Tris(hidroximetil)
aminometano
6,118 g
99,0
HCl
0-5 ml
-
Ensayo de biocompatibilidad. Sumergir el
biomaterial en SBF en una caja Petri y se lleva
a una incubadora por 5 días a temperatura de
36°C, y se procede a separar los biomateriales
para su estudio por MEB.
Extracción de Plasma rico en factores de
crecimiento (PRGF)
Para la obtención de Plasma Rico en Factores
de Crecimiento se procede a la extracción de
sangre del paciente y se dispone en tubos con
anticoagulante (Citrato sódico al 3,8 %) para
posteriormente introducir en una
centrifugadora; la sangre debe centrifugarse
inmediatamente tras la extracción y sin haber
sido refrigerada ni manipulada; equilibrar la
centrífuga y hacer girar la sangre (16 minutos)
a 3200 RPM. Se procede a la extracción del
fragmento de plasma situado por encima de los
elementos conforman la sangre. Toda la
manipulación de los dispositivos hay que
realizarla asépticamente, para minimizar las
posibilidades de contaminar las fracciones de
plasma obtenidas. Todo el procedimiento no
debe pasar de los 45 minutos.
Cabe mencionar que en este trabajo de
investigación no se produjo la activación
plaquetaria con cloruro de calcio, ni gluconato
de calcio Es necesaria la utilización de una
cabina de flujo laminar adecuada en los
procesos de fraccionamiento y activación, que
disminuye el riesgo de contaminación
microbiológica siguiendo la metodología de
Raquel Moreno (9).
Ensayo de biocompatibilidad. Sumergir los
biomateriales en PRPGFen una caja Petri y se
lleva a una incubadora por 5 días a
temperatura de 36°C, y se procede a separar
los cristales para su estudio por MEB.
Ensayos de capacidad antibacterial.
- Preparacion del medio de cultivo.
Se preparó 220 ml de un medio de cultivo en
una autoclave, con Agar Muller Hinton, con una
concentración del medio de cultivo de 8,36
g/L.
- Antibiogramas Técnica de Kirby Bauer
En nuestro caso se utilizó cepas de S. aereus y
E. Coli. y se observó la formación de halos de
inhibición, los resultados se determinan
midiendo las zonas de inhibición del
crecimiento de la bacteria por la efectividad
del antibiótico en el estudio para el caso de los
biovidrios dopados con plata.
Resultados
Preparación de los biomateriales
Los procesos de síntesis utilizados en la
preparación de los biomateriales fueron
satisfactorios, tal como lo muestran los
resultados mostrados por las diferentes
técnicas en la caracterización de los
biomateriales.
Caracterización de los biomateriales
- Análisis Químicos
Los resultados de los análisis químicos
determinados por las distintas técnicas
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analíticas son los mostrados a continuación en
la Tabla 2.
Tabla 2. Composición Química de los biomateriales obtenidos
Componentes
mayoritarios (%)
Biomaterial
Hidroxiapatia
BG
BGAg
SiO2-Li2O
SiO2
-
55,2
51,4
71,5
CaO
52,1
20,5
19,1
-
P2O5
34,9
1,3
1,2
-
Ag2O
-
3,8
-
Li2O
-
-
27,4
Otros
13
23
24,5
1,1
- Difracción de Rayos X
Los difractogramas obtenidos para los distintos biomateriales obtenidos por las diferentes vías de
síntesis, se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Resultados de DRX de los Biomateriales obtenidos.
Biomaterial
DRX
Observación
Hidroxiapatita
Formación de
hidroxiapatita,
con fases
amorfas de
fosfatos en un
porcentaje muy
bajo.
Biomaterial
BG
Formación de
vitrocerámico,
presencia de
fase vítrea y
devitrificaciones
de Silicato
sódico cálcico.
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Biomaterial
BGAg
Se observa la
formación de
fase vítrea y la
ausencia total de
cristales,
átomos de plata
son parte de la
red vítrea.
Biomaterial
SiO2-Li2O
Se observa la
formación de un
vitrocerámico,
fase vítrea y
cristales de
Silicato de Litio
Li
2
SiO
3
- Microscopía Electrónica de Barrido
Las micrografías de los biomateriales obtenidos se muestran en la Tabla 4. Junto a ellas fotografías de
los vidrios o vitrocerámicos obtenidos.
Tabla 4. Micrografías y fotografías de los biomateriales obtenidos
Biomaterial
Micrografía MEB
Observación
Hidroxiapatita
Micrografía MEB de polvos, se
observa la formación de cristales de
hidroxiapatita.
Biomaterial BG
Micrografía MEB en fractura fresca,
se observa la formación de fase vítrea
y cristales
Biomaterial
BGAg
Micrografía MEB en fractura fresca,
similar a Biomaterial BG
Formación de fase vítrea y la ausencia
total de cristales. Fotografia de los
biomateriales obtenidos.
Position [°2Theta] (Copper (Cu))
10 20 30 40 50 60 70 80
Counts
0
2500
10000
MUESTRA - 2
Peak List
00-029-0828
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Biomaterial
SiO2-Li2O
No se realizó.
Se observa la formación de un
vitrocerámico. Fusión en horno de
microondas y crisol de grafito.
- Ensayos de Biocompatibilidad
El seguimiento a la biocompatibilidad, después de la inmersión en los fluidos de SBF y PRP se han
realizado mediante la MEB y la DRX, los resultados encontrados se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Cambios observados en la inmersión en SBF y PRP
Biomaterial
Micrografía MEB
DRX
Observación
Hidroxiapatita
No se realizó, el espectro sería el
mismo porque solo hay
incremento de fases de
hidroxiapatita.
Formación de una
interfase entre
cristales y SBF,
resultados
similares en PRGF.
Biomaterial BG
Formación de
cristales de
hidroxiapatita y
apatita, confirmado
por DRX
Biomaterial
BGAg
Micrografía MEB
en polvo, similar a
BG después de
inmersión en
fluidos.
Formación de
apatita y formación
de Ag2O,
evidenciado por
DRX.
Biomaterial
SiO2-Li2O
No se realizó.
- Ensayos de capacidad antibacterial.
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El ensayo se realizó con el biomaterial BGAg, debido a que es conocida la acción antibacterial de la
plata, obteniéndose los resultados mostrados en la Figura 1.
Figura 1. Acción antibacterial de iones plata presentes en biomaterial BGAg.
Las pruebas antibacterianas muestran una
zona de inhibición claramente visible donde
las bacterias no están presentes alrededor de
los gránulos de vidrio, el diámetro del halo
alrededor de las muestras, en el caso de
S.aureus, alcanzó 10 mm; en el caso de E. coli, 5
mm., según la norma (SNV 195920-1992), una
zona de inhibición superior a 1 mm se
considera adecuada para la actividad
antibacteriana.
Discusión
Los biomateriales obtenidos tienen las
características adecuadas para ser utilizados
como materiales bioactivos.
La caracterización de los materiales nos
muestra que los biomateriales tienen las
características adecuadas para su utilización
en ingeniería tisular, en el caso de la
hidroxiapatita será necesario conformarla y no
tenerla en polvo de forma de forma similar a
trabajos realizados por Gallegos Nieto (10), en
el caso de los biomateriales BG y BGAg o SiO2-
Li2O se tiene estructuras porosas similares a la
estructura osea, lo que permitiría una mejor
interacción con las células y biocomplejos que
favorecen la bioactividad de los mismos como
indica en su artículo Macías-Andrés, V. I. (11),
estos resultados permitirían la
osteointegración.
Los estudios de Difracción de Rayos X
confirman los valores de la composición
química de los biomateriales, y corresponden
adecuadamente a los patrones de las fichas de
difracción de rayos X de cada uno de los
biomateriales obtenidos, resultados son
similares a los encontrados por Londoño (12)
en el caso de la hidroxiapatita y similares a
muchos autores como Quiroga (13) y
Mondragón (14) para el caso de los
biomateriales BG, BGAg y SiO2-Li2O
respectivamente. Los biomateriales han
demostrado en diferentes estudios la
capacidad de regular la liberación de iones de
calcio y contribuir con la formación de tejido
óseo nuevo. Sin embargo, hasta ahora
continúan algunos cuestionamientos, como el
efecto sobre las propiedades mecánicas, el
efecto de diferentes composiciones de
biovidrios y la taza de liberación de iones, etc.
Un aspecto importante a considerar es la
presencia de Ag2O en el caso de BGAg, por lo
que será necesario ver la acción de los iones
plata en el medio y su disponibilidad en el
organismo.
Las pruebas de biocompatibilidad alcanzan
resultados similares a los obtenidos por
autores como Sierra (15) y Fernandez (16), y
la actividad antimicrobiana similares a Febre
(17)
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Conclusiones
La presente investigación muestra que es
posible desarrollar andamios a partir de
distintas materias primas y compuestos
químicos por distintos procesos de síntesis, es
el caso de la hidroxiapatita por reacción
química a partir de compuestos químicos,
vitrocerámicos bioactivos a partir de zeolitas
del tipo clinoptilolita y compuestos químicos o
vitrocerámicos bioactivos a partir de ceniza de
cascara de arroz y carbonato de litio del Salar
de Uyuni.
Los biomateriales sintetizados son de
características similares a otros obtenidos en
laboratorios de otros países, situación
verificada por las técnicas de DRX, MEB, las
pruebas de biocompatibilidad, en PRFG y SBF,
también evidenciadas por las técnicas
indicadas y la acción antibacterial permitirían
desarrollar biomateriales que pueden ser
estudiados in situ en animales, para
posteriormente pasar a ensayos en seres
humanos.
El presente trabajo se constituye en uno de los
primeros trabajos realizados en Bolivia sobre
Ingeniería de Tejidos, con la obtención de
andamios bioactivos, por lo que será necesario
integrar al equipo de investigación a
profesionales de otras disciplinas, lo que nos
permitirá alcanzar resultados de alta calidad y
permitirán su aplicación en la solución de
problemas traumatológicos que requieren la
osteointegración o la regeneración de tejidos
en distintas partes del cuerpo humano.
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